<i id="zi0d8"><th id="zi0d8"></th></i>

    <acronym id="zi0d8"><code id="zi0d8"></code></acronym>

  1. 欧美XXXX做受性欧美88_97人人澡人人爽91综合色区_国内精品久久久久久久久野战_中文字幕亚洲乱码熟女一区二区
    <i id="zi0d8"><th id="zi0d8"></th></i>

      <acronym id="zi0d8"><code id="zi0d8"></code></acronym>

    1. 新聞動態

      免疫共沉淀Co-IP實驗操作步驟

      發布時間:2022-01-18 瀏覽量:2321


      一、原理:

      免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。其原理是:當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。目前多用精制的prorein A預先結合固化在argarose的beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應后,beads上的prorein A就能吸附抗原達到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合;也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。

      其優點為:(1)相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的,處于天然狀態;(2)蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的,可以避免人為的影響;(3)可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。缺點為:(1)可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質-蛋白質相互作用;(2)兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,而可能有第三者在中間起橋梁作用;(3)必須在實驗前預測目的蛋白是什么,以選擇最后檢測的抗體,所以,若預測不正確,實驗就得不到結果,方法本身具有冒險性。

      二、準備工作:

      預冷PBS,RIPA Buffer,細胞刮子(用保鮮膜包好后,埋冰下),離心機

      1. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次,最后一次吸干PBS;

      2. 加入預冷的RIPA Buffer(1ml/107個細胞、10cm培養皿或150cm2培養瓶,0.5ml/5×106個細胞、6cm培養皿、75cm2培養瓶)

      3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下,把懸液轉到1.5EP管中,4℃,緩慢晃動15min(EP管插冰上,置水平搖床上)

      4. 4℃,14000g離心15min,立即將上清轉移到一個新的離心管中

      5. 準備Protein A agarose,用PBS 洗兩遍珠子,然后用PBS配制成50%濃度,建議減掉槍尖部分,避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠

      6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠(50%),4℃搖晃10min(EP管插冰上,置水平搖床上),以去除非特異性雜蛋白,降低背景

      7. 4℃,14000g離心15min,將上清轉移到一個新的離心管中,去除Protein A珠子

      8. (Bradford 法)做蛋白標準曲線,測定蛋白濃度,測前將總蛋白至少稀釋1:10倍以上,以減少細胞裂解液中去垢劑的影響(定量,分裝后,可以在-20℃保存一個月)

      9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl,以降低裂解液中去垢劑的濃度,如果興趣蛋白在細胞中含量較低,則總蛋白濃度應該稍高(如10 μg/μl)

      10. 加入一定體積的兔抗到500μl總蛋白中,抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異

      11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育

      12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物,4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h,如果所用抗體為鼠抗或雞抗,建議加2 μl"過渡抗體"(兔抗鼠IgG,兔抗雞IgG)