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    1. 新聞動態

      重組蛋白表達和純化分析

      發布時間:2022-01-18 瀏覽量:2326

      如果你打算將目的蛋白應用于下游實驗,那么成功表達重組蛋白是很重要的。如果一開始,你花點時間優化蛋白的可溶性,將會大大節約你后續純化的時間。關于重組蛋白表達和純化,可參考如下建議:


      選擇“正確”標簽可能是一項艱巨的任務。理想的標簽將幫助你獲得可溶性蛋白,簡化你的純化方案,并且不會干擾下游應用。然而,考慮到載體可用的切割位點過多,你唯一的擔心應該是哪個標簽將有助于目標蛋白的溶解、表達和純化—標簽總是可以切除的,如果你擔心它會干擾目標蛋白的行為。

      某些標簽,例如谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)或麥芽糖結合蛋白(MBP)被認為可增加蛋白的溶解性。這些標簽的缺點是它們的大小—GST約26kDa,MBP為41kDa。 其他標簽(六聚組氨酸,FLAG,鏈霉親和素)相對較小,通常選擇它們以便于捕獲和純化。 選擇幾個不同的標簽,然后克??!如果可能的話,使用C端標簽,這意味著你純化的任何蛋白將是全長,沒有任何截斷。

      獲得可溶性蛋白

      重組蛋白表達的常見問題是真核蛋白在細菌中表達時傾向于不溶。變性,聚集和/或截短形式的蛋白形成不可溶的包涵體,需要進一步純化和重折疊,這可能是低效的和不完全的。

      以下是獲得可溶性天然蛋白質的三個關鍵參數:

      IPTG濃度

      有可能,宿主中的蛋白表達將通過lac操縱子系統操作。這個系統的詳細解釋可以在別處找到,你加入異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),一種乳糖類似物,控制蛋白的表達。蛋白的表達應處于生長的對數期,即當溶液的波長600(OD 600)處的光密度達到0.4-0.6。 如果你的目標是可溶性蛋白質,最好不要改變細胞中蛋白的折疊功能。已經假定不溶性蛋白可能是由于分子伴侶的存在。因此,使用高濃度的IPTG(> 1mM)可能不總是產生最好的結果。嘗試幾個不同的濃度,看看哪一個給你最高的可溶性蛋白的產量。

      溫度

      偶爾,你可以在37°C的典型溫度下,通過生長和誘導分離可溶性形式的蛋白質,但通常情況下,溶解度在較低溫度下增強??蓢L試在30°C,25°C和18°C下進行誘導。 注意:如果首先在37℃生長,先讓培養物冷卻到誘導溫度,再加入IPTG。

      誘導時間

      更長并不總是更好。對于對宿主有毒的蛋白尤其如此。在誘導期間,每隔幾個小時取樣,并檢查目的蛋白的表達。典型的誘導時間根據溫度而變化:對于37℃,嘗試4小時;對于30℃,進行5-6小時,并且任何低于25℃的溫度應該允許生長過夜。

      預實驗

      將目的蛋白的編碼序列克隆到具有不同標記(例如六組氨酸,谷胱甘肽-S-轉移酶(GST),麥芽糖結合蛋白(MBP))的2-3個載體中。然后選擇三種不同的誘導時間和溫度以及幾種IPTG濃度。進行小規模預實驗。誘導后,分析每個樣本中的(1)未誘導樣本;(2)在不同時間點的誘導樣本;(3)裂解物;(4)可溶性片段。

      將目的蛋白的編碼序列克隆到具有不同標記(例如六組氨酸,谷胱甘肽-S-轉移酶(GST),麥芽糖結合蛋白(MBP))的2-3個載體中。然后選擇三種不同的誘導時間和溫度以及幾種IPTG濃度。進行小規模預實驗。誘導后,分析每個樣本中的(1)未誘導樣本;(2)在不同時間點的誘導樣本;(3)裂解物;(4)可溶性片段。

      以上建議都沒有達到預期的效果?

      雖然遵循了上面的建議,你可能會發現,你仍然無法獲得可溶性蛋白,或許可以嘗試如下解決方案:

      只表達目標蛋白的一部分:較小的結構域通常是可溶的,即使全長蛋白不是;

      使用不同的表達系統:這甚至可能保留目標蛋白的翻譯后修飾;

      在變性條件下純化:雖然不總是最好的方法,在變性條件下(即在高濃度的胍或尿素的離液鹽中)純化有時是唯一的解決方案。通常這些條件可以給你一個更純的樣品,因為可溶性污染蛋白被移除。唯一的問題是重折疊;然而,有許多方案可用于包涵體蛋白的重折疊。